目的基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息, 设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂, 将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接, 构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体, 尾静脉注射感染小鼠, 24 h后采血查获疟原虫后, 给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫, 喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定, 最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠, 8 d后采血镜检疟原虫, PCR鉴定, 筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内, 每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片, 经吉姆萨染色后镜检计算原虫率, 记录数据进行统计学分析。结果PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列, 与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d, 用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失, 用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带, 片段长度1 246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序, 测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上, 通过有限稀释感染12只小鼠, 经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带, 检测不到野生型疟原虫的残留, 获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症, 且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天, 2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株, 为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

目的：了解低温（-18℃、-72℃）冻存对中国河南株旋毛虫肌幼虫（肌幼虫）生存能力和感染力的影响。方法：将含有肌幼虫的小鼠骨骼肌肌肉经-18℃、-72℃冻存处理不同时间后观察肌幼虫活力；55只小鼠分别经口感染300条经过-18℃、-72℃处理不同时间的肌幼虫，感染小鼠35 d后收集肌幼虫，测定生殖力指数（RCI）。结果：肌幼虫经-18℃冻存0、6、12、24、36、48 h的死亡率分别为0.00%、6.30%、18.23%、35.81%、74.60%及100.00%；经-72℃冻存0、15、30、45、60 min的死亡率分别为0.00%、21.21%、57.11%、86.24%及100.00%；肌幼虫死亡率随-18℃、-72℃冻存处理时间的延长而升高（P<0.01）。经过-18℃冻存处理6、12、24、36 h后感染小鼠的肌幼虫RCI分别为（126.38±6.90）、（68.58±4.83）、（12.58±1.77）、（5.77±0.77），与未冻存（0 h）组肌幼虫的RCI（163.70±10.70）差异均有统计学意义（P<0.01）；通过-72℃冻存处理15、30、45 min后感染小鼠的RCI分别为（18.19±2.15）、（8.83±1.39）、（3.10±0.26），与未冻存（0 min）组肌幼虫的RCI（163.70±10.70）差异均有统计学意义（P<0.01）；肌幼虫的RCI均随-18℃、-72℃冻存处理时间延长而下降（P<0.01）。结论：低温冻存可导致中国河南株肌幼虫存活能力和感染能力下降，-18℃冻存48 h或-72℃冻存60 min可完全灭活小鼠肌肉内的中国河南株肌幼虫。